前言
空肠弯曲菌（Campylobactorjejuni）是一种食源性人兽共患病原菌，在禽类、牛、羊等动物体内正常定植。人主要是通过食用被污染的食物、水以及奶制品等被感染］，对人致病的弯曲菌中90%是空肠弯曲菌，其次是结肠弯曲菌、胎儿弯曲菌等。空肠弯曲菌的感染可引起胃肠炎，导致菌血症、反应性关节炎、脑膜炎等肠道外症状，某种特定的血清型还可以导致格林–巴利综合症，使感染者因呼吸麻痹而死亡。近年来，空肠弯曲菌引起的疾病呈逐年上升趋势。研究发现，在美国等发达国家空肠弯曲菌感染的数量超过沙门菌、志贺菌和大肠埃希菌O∶H7。国内对空肠弯曲菌的研究也日益受到重视。目前腹泻患者空肠弯曲菌的感染现状及病原特征仍缺乏充足的基础资料。近期，Liang等研究发现，新的双孔滤膜法检测技术能显著提高弯曲菌的检出率，为进一步获得深圳市南山区秋季腹泻患者弯曲菌的感染现状及病原特征，本研究连续收集年9－11医院份腹泻患者的粪便标本，采用新的双孔滤膜法分离弯曲菌并对分离菌株进行分子分型和抗生素敏感性分析，同时本研究汇总了本地区的既往分离菌株，进行基于序列分型（ST）的最小生成树分析，获得本地区腹泻患者感染菌株的病原特征，为弯曲菌感染的防控提供数据。01
材料与方法
1.1 材料 1.1.1 样本采集 年9－11月采集深医院腹泻患者粪便标本份。其中0~6岁患者标本6份，7～17岁患者标本12份，18～0岁患者标本66份，1～65岁患者标本20份，66岁以上患者标本6份。1.1.2 菌株 空肠弯曲菌ATCC由中国疾病预防控制中心传染病预防控制所惠赠，空肠弯曲菌的最小生成树聚类分析包含的部分菌株由年课题组分离所得。1.1.3 仪器与试剂 Karmali培养基（美国OXOID）、弯曲菌培养检测试剂盒和弯曲菌琼脂稀释法最小抑菌浓度（minimuminhibitoryconcentration，MIC）检测试剂盒（青岛中创生物科技有限公司）、空肠弯曲菌核酸检测试剂盒（生科原股份有限公司）、智能厌氧培养系统（RSBIOTECH）、QIAGENLarge-ConstructKit（德国QIAGEN）、荧光定量PCR仪（美国Bio-Rad）、多位点序列分型（MLST）的扩增及测序引物合成（广州生工生物科技有限公司）、CHEFMapper脉冲场凝胶电泳仪和凝胶成像系统（美国Bio-Rad）、蛋白酶K、SmaⅠ、XbaⅠ限制性内切酶（美国NewEnglandBioLabs）、SeaKem?GoldAgarose（美国Lonza）。1.2 方法 1.2.1 菌株的分离鉴定 挑取约2个黄豆粒大小（如果是水样便，取1ml）的粪便直接装入弯曲菌样本采集管中（含弯曲菌样本采集液ml），于℃运回实验室，当天进行检测。将样本采集管充分振荡混匀，吸取1ml混合液于增菌液中，轻微振荡混匀，微微拧松瓶盖，微需氧环境（5%O2，10%CO2，85%N2）下2℃增菌2h。取μl增菌液，分成～6个点，分别滴加于贴了滤膜的双孔板上，待水分充分透过滤膜后，揭去滤膜，翻转平板于微需氧环境下37℃培养2～8h。挑取可疑菌落纯化后，用成品试剂盒进行荧光PCR鉴定。1.2.2 MLST 根据QIAGENLarge-ConstructKit试剂盒的说明书进行DNA模板的提取，7对管家基因的扩增引物和7对测序引物参照MLST数据库（转载请注明：http://www.szpengmignde.com/fzfxyy/5025.html
